技术问题

一、综合性问题

1、  试剂表面基团的量或者浓度——需分表列明

PLL@Fe2O3表面带的多聚赖氨酸量或是比例是多少

质量比是PLL：Fe=0.2：1

2、  浓度

（1）浓度

PEI@Fe3O4，PEG化氧化铁，PLL@Fe2O3的铁浓度是1mg/ml，

DMSA@Fe2O3，DMSA@Fe3O4和APTS@Fe2O3的铁浓度是4mg/ml

OA@Fe3O4，柠檬酸钠修饰的Fe3O4，纳米银浆按总质量算

银纳米颗粒0.1mg/ml

金纳米颗粒的OD值一般是5，金单质的质量0.05mg/ml(金质量计)。

3、  产品溶剂或产品成分

4、  颗粒稀释是否可以用去离子水？

可以

5、  产品如何灭菌？可以高温或者其他手段？

产品在出售前已经用0.22微米的滤膜除过菌，无需再次除菌。另高温会破坏产品性状，不可高温灭菌

  6、产品保质期多久？在使用过程或者存放久了发生产品聚集的问题如何解决？

我们的产品保质期是12个月。在保质期内，我们的产品一般是不会出现团聚现象的，若您买回的产品还未使用，也未添加任何试剂，又在保质期内，我们承诺是可以免费退换的。

   7、磁性是多少？

70emu/g，我们产品的这个磁性强度还是比较大的，也是我们产品的优势之一。

   8、生物相容性好，用什么数据说明呢？

做细胞活性实验，加入量后，看细胞有没有死亡,要是没有死亡,说明相容性很好.

   9、产品浓缩，如果离心一般多少转速合适？

稳定的话1万30分钟都不能完全离下来，不稳定的话5000转5分钟就可以了。

   10、纳米颗粒的饱和磁化强度是用什么检测的？

振动样品磁强计。

   11、3.5mg/mlMnZnFe2O4@OA中3.5mg/ml指什么？

3.5mg/ml就是Fe的含量。（OA是油酸）

   12、你们磁性纳米颗粒的制作方法是什么？共沉淀？

目前我们的产品大部分是用共沉淀法制得的，用共沉淀法制得产品也是最稳定的，申请的国家二级标准物质也是用共沉淀法制得的，我们这有高温热解法做的，但不能批量成产，所以价格比较贵。

   13、你们的磁性纳米颗粒怎么实现靶向的作用呢?

抗体靶向，或者用磁铁吸。

   14、你们在什么仪器上测粒径分布的

DLS是粒度电位分析仪（Malvern，ZETA SIZER ，Nano ZS90），电镜尺寸通过“力度分布计算”软件分析得到的

二、DMSA@Fe3O4

   1、DMSA@Fe3O4的摩尔浓度是多少呢？是用原子吸收测试的吗？

A：因为产品的4mg/ml是以Fe来计的，所以该产品的摩尔浓度是4/56=0.0714mol/L.产品浓度不是用原子吸收测试的，是用紫外可见光谱测试的，用邻二氮菲显色测试的。

   2、DMSA@Fe3O4怎么稀释保存

超纯水稀释，然后用0.1M的四甲基氢氧化铵溶液调pH到中性或稍偏碱性保存。

   3、DMSA@Fe3O4简介

颗粒外围是二巯基丁二酸，羧基来自于二巯基丁二酸，最外层就是羧基，电镜尺寸一般在10nm左右。一般注射活体都用这个，二巯基丁二酸就是指DMSA。水相的磁性纳米颗粒就是DMSA@Fe3O4。

   4、小鼠MRI造影时的推荐用量（如DMSA@Fe3O4），不同肿瘤用量是否也会不同

稍有不同，可根据具体情况做相应调整，一般的推荐用量是100mg铁每千克小鼠体重

 5、  DMS@Fe3O4表面包被的是什么？

颗粒是DMSA表面修饰的

 6、  有相应的蛋白质交联试剂盒么？还是我们自己要摸索EDC+Solfo-NHS的用量？

可以用EDC/sulfo-NHS的方法偶联，这个方法比较成熟，但是涉及到在纳米颗粒偶联的时候其实最主要的是要保持颗粒的稳定性，颗粒的稳定性与电荷有很大关系，所以用不同等电点的蛋白质进行偶联在反应缓冲液pH上是不同的，所以我们没办法做出相应的试剂盒。到时候我们会提供一个大概的偶联步骤，里面有试剂、蛋白质、偶联剂的用量和缓冲液的信息等，基本您可以照着做，针对您的蛋白质您还可以稍做一些调整，尤其是缓冲液的选择。如果您实在不愿意做的话，也可以交给我们公司帮您做，公司也有定制化的业务，但需要另外收费。

三、DMSA@Fe2O3

   1、羧基化Fe2O3磁性纳米颗粒的水动力尺寸？

40-70nm。

四、PEI@Fe3O4

   1、PEI_Fe3O4能否进入到细胞核

不能进入

   2、产品是因为什么原因进不了细胞核呢？是粒径大了进不去吗？如果进行表面修饰，有可能进核吗？怎样修饰进核呢？你们公司能帮忙做修饰吗？

   3、贵公司用于RNA转染的纳米颗粒，其表面修饰的有机物是PEI吗？有机物的含量是怎样的呢？

我们公司的磁转染纳米材料是Fe3O4纳米颗粒的核，表面用PEI修饰，PEI的量没有做过具体分析，但表面电位较正，已经可以证明PEI的成功修饰，如有必要后面可能会考虑做热重等。

   4、贵公司用于RNA转染的纳米颗粒电镜尺寸如何？在超纯水中的表面电势是怎样的？

电镜尺寸在10nm左右，最终产品分散在纯水中，zeta电位高于30mV（测量值一般在40～50mV之间）

   5、为了直观验证RNA被转入细胞，我想用荧光染料标记RNA，再与纳米粒子结合，结合后是否会导致荧光的淬灭？

我们曾经做过用荧光标记纳米颗粒的研究，没有发现会导致荧光淬灭的现象，只要您注意避光操作，应该不会产生影响

   6、与RNA混合后，粒子会否团聚？对转染的效率影响如何？

A：与RNA混合后是否团聚主要与电荷有关，当溶液中负电荷过高时会导致团聚，团聚确实会影响转染效率，且会导致细胞毒性增加。根据我们客户的使用反馈，按照正常使用比例不会导致颗粒聚集，这也是我们产品的优势之一。

五、PEG化氧化铁

   1、在磁性纳米颗粒上接分子量约3000的肽段，选PEG化的氧化铁合适吗？

合适，PEG化四氧化三铁比其他同类产品更抗吞噬，靶向性更强

   2、肽段修饰在磁性纳米颗粒上，复合物的水动力尺寸还在纳米级别吗？

在的

   3、小肽需要多少量？（PEG化磁性纳米颗粒（羧基末端）5mg）

质量比一般是Fe：小肽=1:0.5到1:1

   4、货期多长

定制一般是三个月

六、裸γ-Fe2O3

   1、磁性纳米材料的制备方法？

裸γ-Fe2O3的制备主要有两种方法：共沉淀法和高温热解法。共沉淀法是目前用来批量生产磁性纳米颗粒的主要方法，本实验室也采用此方法，其缺点是颗粒分散不均匀，大小不均一。高温热解法是目前比较热门的一种研究方法，目前不能批量生产，但是颗粒均匀分布TEM照片特别漂亮。若有客户想要高温热解法的产品，可以提供，但是价格另算，要高很多。

七、细胞标记

   1、干细胞标记方法？

取纳米颗粒用无血清的培养液稀释成20ug/mL左右，加入细胞，30min后补加血清，孵育12-24h.

   2、细胞标记有哪些检测方法？

一般是MRI造影和组织切片做普鲁士蓝染色

   3、连接上抗体后是用紫外测试？还是用核磁质谱分析呢？如何验证连接的成功与否？

都可以，做紫外测试时，因为铁的吸光度比较大，所以需要蛋白含量多一点，连接的多，看的也清楚，质谱的也做，但是做的不多。要验证连接的成功与否，做一个纯化步骤，一般有离心或者过凝胶柱等，看分离出来的铁那部分有无蛋白，若量多的话，用紫外直接做，因为是测试蛋白含量，推荐您使用BCA试剂。

   4、你们有没连接抗体的步骤，能不能发给我们先看一下？

抗体连接步骤很多，一般有EDC，但是具体的连接方法还是要自己查文献的。

   5、你们的纳米颗粒被细胞吞噬的多？有没有细胞毒性？应该是吞噬的多好还是少好啊？

具体的吞噬多少是无法测试的，但是若用我们推荐的方法，我们可以保证细胞的标记率达90%以上。细胞毒性是有的，但是很低，要看细胞是不是比较敏感，一般40ug/mL是没有问题的。若细胞吞噬的越多，毒性自然就大，但是吞噬的越多，实验显现的效果越好，所以要选一个合适的比例。

   6、蛋白质和磁珠的物质的量的比是多少，毕竟我们的抗体是个单域抗体，分子量小很多。

我们是按质量比来加的，Fe跟抗体质量比为1：1，我们的抗体分子量是150k，我们的体系里面抗体是过量的。

   7、但是我们的抗体只有15k,也照质量加的话会不会过量太多了？

如果抗体分子量小的话可以按质量Fe:抗体=10：1。

   8、在标记之后还是要浓缩一下的，还是大概超滤下好了？

最好不要，你们没有合适的浓缩手段，很容易导致聚集的，尽量在偶联过程中不要把体积打的太大。

   9、Fe的最佳标记浓度是多少？拿到产品要不要做什么稀释动作？

取微量铁分散在培养液中，保证每ml培养液含20ug铁，具体的量要根据客户的实验情况而定。

   10、蛋白质和磁珠反应后如何分离？过柱子还是采用透析？多出来的硼酸体系要除去吗？（袁辉老师）

如果稳定的话可以过柱子，不稳定的话适当离心即可，硼酸体系是用来缓冲的，不必去除。

八、造影

1、  我们造影用的MRI机型及设置参数？

德国siemens公司 avanto 1.5T

2、  做磁性靶向，需要推荐纳米材料？

油酸修饰的、PEG修饰和DMSA修饰的都可以用。但是主推PEG@Fe3O4，因为有机相的不能用在动物体内会有毒性，DMSA@Fe3O4（制备方便）属于水相试剂，毒性小，PEG@Fe3O4为水相溶剂，毒性小，靶向性好

   3、注射到小鼠体内的剂量如何才能够不导致小鼠的死亡？

A: 当注射剂量按照每千克体重0.5mg铁的量注射时，小鼠是不会死亡的。（0.5mg/kg体重是推荐剂量，就是说这个剂量就会有效果，但是不能保证这个剂量就能够不使得小鼠死亡，死亡的原因很多，如果注射速度过快也会导致死亡的）

   4、小鼠注射时是不是转换到PBS那种中性的环境比较保险呢，怕小鼠受不了

A：中性环境的进行偶联反应容易导致团聚，这个PH跟蛋白质的等电点关系很大，您可以试下，我们就是这样做的，我们偶联的如avastin或者美罗华都必须在PH9下做。

特殊性问题

   1、我们是用来看动脉粥样硬化易损斑块的，按照理论，我们是不希望被腹腔内的巨噬细胞吞噬，希望都进入斑块内部？

若产品部稳定，那被巨噬细胞吞噬的机会就会大一点，若产品稳定的话，就比较容易进入斑块内部，之前东大有做过类似这样干细胞的实验，实验结果就是进入斑块内部的比较多。我们的产品是比较稳定的，分散性好，最终分散在水中，这也是我们的产品优势之一。

   2、小鼠肿瘤注射的注射方案

按铁浓度为1mg/ml算，注射量是肿瘤体积的一半（肿瘤体积计算方式是(ab²)/2,a是指肿瘤的长径，b是指肿瘤的短径）。值得注意的是注射需要比较细的针如胰腺灌注针进行多靶点注射

   3、CT造影用碘油纳米乳动物实验

购买后一般4度密封可长期保存，也可在常温下短期存放。这款产品相对比较稳定，而且效果很好。小鼠注射量推荐量是100到200微升（碘浓度：48mg/ml），通过尾静脉注射1到4小时内会观察到明显的造影图像。因为该造影剂被动靶向到肝，可设置不同时间节点的对照，比如1h，4h，8h，12h，24h等